Medio de montaje para microscopía óptica

de alta resolución

Fecha: 31 de Diciembre de 2021

Los avances en la microscopia óptica han logrado que sea posible ver detalles cada vez más pequeños, incluso superando el límite de la resolución. Lo cual impone el reto de optimizar todos los procesos involucrados en obtener la mejor calidad posible de una imagen. Dentro de estos procesos se encuentra la preparación de la muestra que deseamos analizar y más específicamente es necesario mejorar las propiedades del líquido en el cual se encuentra inmersa la muestra.

Cuando la luz pasa de un medio a otro, por ejemplo del aire al agua, cambia su velocidad de propagación y por lo tanto cambia su dirección, se dobla. Es por eso que un lápiz parcialmente sumergido en agua parece verse partido, esto ocurre cuando el índice de refracción de los medios es diferente. En microscopía aprovechamos esa propiedad de la luz para magnificar una imagen, sin embargo, hay un material que usualmente queda fuera del control del diseño óptico y es la muestra biológica. Los sistemas ópticos están diseñados de manera estándar para ser usados con una gran variedad de muestras independientemente de su índice de refracción, sin embargo, si queremos llevar el sistema a su máxima capacidad debemos buscar que el índice de refracción de la muestra coincida con el del vidrio en el que está soportada.

Tradicionalmente las muestras biológicas se deben colocar entre dos vidrios (un portaobjetos y un cubreobjetos) y para asegurar su preservación no podemos dejarlas secar sino que debemos colocarlas en un líquido, ese líquido es el medio de montaje. Las características ópticas del medio de montaje pueden limitar la resolución de la imagen y por lo tanto deben ser mejoradas para obtener la mejor imagen posible.

La microscopía de fluorescencia posibilita la obtención de imágenes de estructuras celulares de manera altamente selectiva, por ejemplo: tiñendo con un marcador fluorescente el núcleo y con otro marcador fluorescente de otro color los filamentos de actina de las células. De esa manera, podemos usar luz láser de un color para hacer fluorescer el núcleo y otro color de láser para hacer fluorescer la actina, por separado. Este tipo de imágenes son muy útiles para poder comprender las estructuras al interior de las células.

En el CIO hemos optimizado un medio de montaje para microscopía de fluorescencia, cuyo índice de refracción, al ser muy cercano al del vidrio, posibilita la adquisición de imágenes con mayor resolución. Nuestro medio de montaje es transparente, incoloro, no tóxico y funciona muy bien como medio de montaje para microscopia de alta resolución ya que su uso con células y fluoróforos comunes no tiene inconvenientes.

Nuestra propuesta de medio de montaje es conocido como TDP (3,3´-tiodipropanol) y tiene la gran ventaja por sobre su más cercano competidor TDE (3,3´-tiodietanol) en que sí se puede usar con el sistema basado en faloidina (reactivo) para marcar filamentos de actina.

La actina es una proteína presente en todas las células eucariotas, esta proteína forma los filamentos de actina cuyas funciones principales son: mantener o cambiar la forma de las células, la contracción muscular, el movimiento celular y también la división celular. El reactivo más popular para marcar la actina es la toxina faloidina. El marcaje de actina con fluoróforos conjugados a faloidina es muy relevante ya que no sólo es el método más popular para marcar filamentos de actina, sino que produce un marcaje de alta calidad siguiendo un protocolo simple.

Existen algunas preparaciones a partir de varios químicos que se usan para obtener medios de montaje, con índices de refracción adecuados para la imagenología de alta resolución, pero su uso es mucho más complicado y son generalmente más costosos o su compatibilidad no ha sido comprobada con tinciones basadas en faloidinas ni tampoco con una amplia variedad de fluoróforos, lo cual es un plus de nuestra propuesta de uso del TDP. Otra desventaja de algunos medios de montaje que pueden tener índices de refracción parecidos al del TDP es que al momento del montaje son líquidos y aumentan su índice de refracción con el tiempo al “endurecer”, esto podría implicar cambios morfológicos en las muestras a analizar.

Por otra parte, existen medios de montaje basados en resinas que tienen índices de refracción altos, pero la preparación de las muestras para ser montadas en estos medios involucra procesos de deshidratación, que no siempre son deseados, o que son más trabajosos. Además, las resinas en muchos casos tienen autofluorescencia, lo cual no las hace ideales para microscopia de fluorescencia.

Las posibles aplicaciones de este desarrollo se dan en dos áreas, la de la investigación básica y en la industria farmacéutica. Contar con un medio de montaje que posibilita acceder a la visualización de los filamentos de actina con alta resolución, implica una mejora en la reconstrucción en tres dimensiones del citoesqueleto de actina, por lo que el estudiar en detalle la morfología también significa poder analizar estructuras en tres dimensiones.

La microscopia de fluorescencia beneficia el estudio básico de los procesos patológicos de toda enfermedad, incluyendo diabetes, obesidad, cáncer y hasta enfermedades infecciosas como SIDA, Dengue y COVID; ya se usa en sistemas de diagnóstico clínico de algunas enfermedades, como algunos tipos de cáncer, o enfermedades del sistema inmunológico. El área comercial que más uso hace de aplicaciones de microscopía es la industria del fármaco que comúnmente analiza los efectos de las drogas en células y tejidos en paralelo (high throughput).

TDP es mucho más económico que los medios de montaje comercializados para fluorescencia, sin embargo no es tan económico como TDE. Es por eso que las mezclas de TDE y TDP también son una buena opción cuando se trata de tomar imágenes de alta resolución del citoesqueleto de actina, por una parte TDE hace más económico aún al medio de montaje y por otra parte TDP lo hace compatible con el marcaje de faloidina. Explorar más en el uso de estas mezclas es una de las opciones de montaje que pueden investigarse más a futuro.

Otra aplicación que se podría beneficiar del uso de TDP es la microscopía óptica de súper resolución. Todavía no nos ha sido posible incursionar en esta área, sin embargo, es una de las aplicaciones que más podrían aprovechar este medio de montaje para el estudio de detalles nanométricos de células y tejidos.

Figura. TDP permite tomar imágenes de estructuras celulares con alta resolución. A. Células HEK-293, citoesqueleto de actina marcado en verde con faloidina. B. Células SHY-5Y, cito esqueleto de actina marcado en rojo con faloidina y citoesqueleto de tubulina inmunomarcado en verde. C. Células HeLa, citoesqueleto de actina marcado en rojo con faloidina, En A, B y C los núcleos son teñidos con DAPI, en azul.

Este proyecto fue financiado por Convenio SICES 094/2016CIO La patente del medio de montaje se encuentra en la etapa de examen de forma.